猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）荧光PCR检测是防控猪伪狂犬病的重要手段，该方法具有较高的敏感性、特异性和能够快速检测高通量样品等优点。但在日常的检测中仍不可避免的出现假阳性的情况，从而影响实验结果的判定。由于目前的检测大多使用商品化试剂盒，所以日常检测中产生的假阳性现象多是实验操作或环境因素所导致。包括检测人员操作不规范、不熟练，未在独立的生物安全柜中进行样品提取与试剂配制，实验室通风不良、清洁消毒不彻底，样品或提取模板间产生交叉污染，PCR检测试剂、阳性质粒发生污染。因此本文就以上几种原因做出详细解释并提出相应改进措施。

一、产生假阳性结果的原因

1、试验开始前或结束后清洁消毒不彻底

试验开始前或结束后，未对试验桌面、废液缸和仪器设备等进行彻底消毒，从而在相关设施设备表面留下污染源。

2、样品提取与试剂配制过程未在生物安全柜中进行

样品提取与试剂配制均需要在生物安柜中进行，以避免在加样过程中混入外源性核酸物质，从而造成反应体系的污染。

3、实验室通风设备运转不良

实验室设备的故障或是运转不良，会造成实验室空气流通不畅，带有污染源的空气不能被通风系统及时排出，致使室内空气中存在含有核酸片段的气溶胶，最终导致反应体系的污染。

4、交叉污染

样品或反应体系由于密封不严而溢于容器外、掀盖过猛导致液体迸溅，会造成不同样品间产生交叉污染，影响结果准确性。

5、PCR试剂、阳性质粒污染

PCR扩增体系配制过程中，未使用无菌枪头或未更换移液器枪头、试剂盖或PCR管接触污染台面、未使用无酶EP管、未使用无酶水稀释样品和试剂均会造成试剂被核酸污染。克隆阳性质粒浓度高，在稀释过程中若未严格按照梯度稀释或及时更换枪头，很有可能造成污染。

二、避免假阳性产生的措施

1、做好试验前准备

（1）试剂分装。对PCR扩增体系所需要的试剂和阳性质粒，在生物安全柜中使用无酶水对其进行稀释，并使用无核酸酶耗材，在分装成小包装后进行日期的标注，以便在产生污染时及时溯源。

（2）实验前消毒。对生物安全柜内的废液缸、镊子、PCR板架以及桌面使用75%酒精消毒，并使用紫外灯照射30min以上。

（3）通风。尽量选择具有负压系统的实验室进行反应体系的配置，在不具备该条件的情况下，要尽量做到室内的消毒，以确保环境中不含有潜在的核算污染源，并在操作过程中打开生物安全柜的通风功能。

2、设立多个技术性重复对照

在反应体系的配置中，可将阴、阳性对照设置2-3个重复，从而规避由操作不当带来的试验偏差。

3、规范试验操作

（1）开展本试验的检测人员，必须经培训合格后上岗，切实掌握PCR检测操作原理、方法和步骤，严格按照实验室建立的检测操作规程和作业指导书进行各项实验活动。

（2）人员进入不同区域，须穿戴各区域专用的实验服、手套、口罩、帽子，切勿混穿在不同房间流动。

（3）取样和加液时，应先通过瞬时离心等方式，使管盖上液体完全沉于管底；开管动作要轻，以避免内液体溅出发生交叉污染或产生气溶胶污染环境。

（4）PCR反应体系配制好后，应加入核酸模板，然后盖紧反应管。PCR扩增完成后，尽量减少打开密封反应体系的次数，如必须打开，应在独立专用区域内。

（5）禁止把PCR产物带到配制PCR体系的区域内，同时禁止在配制PCR反应体系的区域内，操作含核酸或质粒的溶液。